Il-metodu ta 'osservazzjoni prinċipali tal-mikroskopju ottiku huwa l-osservazzjoni tal-fluworexxenza
Fenomenu tal-fluworexxenza
Il-fluworexxenza tirreferi għall-proċess li fih sustanza fluworexxenti temetti dawl b'wavelength itwal kważi simultanjament meta irradjata b'dawl ta 'wavelength speċifiku (Figura 1). Meta dawl ta 'wavelength speċifiku (eċċitazzjoni wavelength) jolqot molekula (bħal molekula f'fluworophore), l-enerġija tal-foton tiġi assorbita mill-elettroni tal-molekula. Sussegwentement, it-tranżizzjoni tal-elettroni mill-istat fundamentali (S0) għal livell ogħla ta 'enerġija, l-istat eċċitati (S1'). Dan il-proċess jissejjaħ eċċitazzjoni①. L-elettron jibqa' fl-istat eċċitati għal 10-9–{10-8 sekondi, li matulhom l-elettron jitlef xi enerġija ②. Fil-proċess li titlaq mill-istat eċċitati (S1) u terġa 'lura għall-istat ta' l-art ③, l-enerġija li jifdal assorbita matul il-proċess ta 'eċċitazzjoni se tiġi rilaxxata.
Il-ħin ta 'residenza ta' molekula fluworexxenti fl-istat eċċitati huwa l-ħajja tal-fluworexxenza, ġeneralment f'nanosekondi, li hija karatteristika inerenti tal-molekula fluworexxenti nnifisha. It-teknoloġija tal-immaġini bl-użu tal-ħajja tal-fluworexxenza tissejjaħ Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), li tista 'twettaq kejl funzjonali u preċiż aktar fil-fond flimkien mal-immaġni tal-intensità tal-fluworexxenza biex tikseb konformazzjoni molekulari, interazzjonijiet intermolekulari u mikroambjenti molekulari. informazzjoni li hija diffiċli biex tinkiseb bl-immaġni ottika konvenzjonali.
Proprjetà oħra importanti tal-fluworexxenza hija ċ-ċaqliq Stokes, id-differenza fil-wavelength bejn il-qċaċet tal-eċċitazzjoni u tal-emissjoni (Figura 2). Normalment il-wavelength tad-dawl tal-emissjoni huwa itwal mill-wavelength tad-dawl tal-eċitazzjoni. Dan għaliex wara li s-sustanza fluworexxenti tkun eċitata u qabel ma l-foton jiġi rilaxxat, l-elettroni jitilfu parti mill-enerġija permezz tal-proċess ta 'rilassament. Sustanzi fluworexxenti b'ċaqliq akbar ta' Stokes huma aktar faċli biex jiġu osservati taħt mikroskopju fluworexxenti.
Mikroskopji tal-Fluworexxenza u Blokki tal-Filtri tal-Fluworexxenza
Il-mikroskopija tal-fluworexxenza hija mikroskopju ottiku li juża proprjetajiet tal-fluworexxenza biex josserva u immaġni, u tintuża ħafna fil-bijoloġija taċ-ċelluli, newrobijoloġija, botanika, mikrobjoloġija, patoloġija, ġenetika u oqsma oħra. L-immaġini ta 'fluworexxenza għandha l-vantaġġi ta' sensittività għolja u speċifiċità għolja, u hija adattata ħafna għall-osservazzjoni tad-distribuzzjoni ta 'proteini speċifiċi, organelli, eċċ fit-tessuti u ċelloli, l-istudju tal-ko-lokalizzazzjoni u l-interazzjoni, u t-traċċar tal-dinamika tal-ħajja proċessi bħal bidliet fil-konċentrazzjoni tal-joni.
Il-biċċa l-kbira tal-molekuli fiċ-ċelloli ma jiffluworexxewx, u sabiex tarahom, iridu jkunu ttikkettjati b'mod fluworexxenti. Hemm ħafna metodi ta 'tikkettjar fluworexxenti, li jistgħu jiġu ttikkettjati direttament (bħall-użu ta' DAPI biex tittikkettja d-DNA), jew immunostaining bl-użu tal-proprjetajiet li jorbtu l-antiġenu ta 'antikorpi, jew il-proteina fil-mira tista' tiġi ttikkettjata bi proteini fluworexxenti (bħal GFP, aħdar proteina fluworexxenti), jew rbit riversibbli. żebgħa sintetika (bħal Fura-2), eċċ.
Fil-preżent, il-mikroskopju tal-fluworexxenza sar it-tagħmir standard tal-immaġni ta 'diversi laboratorji u pjattaformi tal-immaġini, u huwa helper tajjeb għall-esperimenti ta' kuljum tagħna. Mikroskopji fluworexxenti huma prinċipalment maqsuma fi tliet kategoriji: mikroskopji fluworexxenti wieqfa (adattati għat-taqsim), mikroskopji fluworexxenti invertiti (adattati għal ċelloli ħajjin, b'kont meħud ta 'sezzjonijiet), mikroskopji sterjoskopiċi fluworexxenti (adattati għal kampjuni akbar, bħal pjanti, zebrafish (adulti/ embriju), medaka, organi tal-ġrieden/firien, eċċ.).
Il-blokka tal-filtru tal-fluworexxenza hija l-komponent ewlieni tal-immaġini tal-fluworexxenza fil-mikroskopji. Tikkonsisti minn filtru ta 'eċitazzjoni, filtru ta' emissjoni u splitter tar-raġġ dichroic. Huwa installat fir-rota tal-filtru, bħall-Leica DMi8 mgħammra b'rota tal-filtru tal-pożizzjoni 6- (Figura 3). ). Mikroskopji differenti għandhom pożizzjonijiet tar-roti differenti, u xi mikroskopji jużaw slides tal-filtri.
Il-blokka tal-filtru għandha rwol importanti fl-immaġini tal-fluworexxenza: il-filtru tal-eċitazzjoni jagħżel id-dawl tal-eċitazzjoni biex iħeġġeġ il-kampjun u jimblokka wavelengths oħra tad-dawl; id-dawl li jgħaddi mill-filtru ta 'eċitazzjoni jgħaddi minn dichroic beamsplitter (ir-rwol tiegħu huwa li jirrifletti d-dawl ta' eċċitazzjoni u jittrasmetti l-fluworexxenza), Wara r-riflessjoni, huwa ffokat mill-lenti oġġettiva, irradjat mal-kampjun, u l-fluworexxenza korrispondenti hija eċċitati biex jarmu d-dawl. Id-dawl emess jinġabar mil-lenti oġġettiva, jgħaddi mill-isplitter tar-raġġ dichroic, u jilħaq il-filtru tal-emissjoni. Kif muri fil-Figura 4: il-wavelength ta 'eċitazzjoni huwa 450-490 nm, is-divider tar-raġġ dichroic jirrifletti dawl iqsar minn 510nm, jittrasmetti dawl itwal minn 510nm, u l-firxa li tirċievi dawl ta' emissjoni hija 520-560 nm.
Il-filtri tal-fluworexxenza komunement użati fil-mikroskopji tal-fluworexxenza jistgħu jinqasmu f'żewġ tipi: pass fit-tul (LP fil-qasir) u pass band (BP fil-qosor). Il-bandpass huwa normalment iddeterminat mill-wavelength ċentrali u l-wisa 'tal-intervall, bħal 480/40, li jfisser li dawl minn 460-500nm jista' jiġi mgħoddi. Filtri longpass, bħal 515 LP, jgħaddu dawl b'wavelengths itwal minn 515 nm (Figura 5).
Sustanzi fluworexxenti għandhom il-kurva karatteristika tagħhom ta 'eċitazzjoni (assorbiment) u l-kurva ta' l-emissjoni, il-quċċata ta 'eċitazzjoni hija l-wavelength ta' eċċitazzjoni ideali (effiċjenza għolja ta 'eċitazzjoni, li tista' tnaqqas l-enerġija tad-dawl ta 'eċitazzjoni, tipproteġi ċelloli u żebgħa), u l-kurva ta' emissjoni hija l-wavelength tal-fluworexxenza tal-emissjoni firxa. Għalhekk, fl-esperiment, aħna se nagħżlu l-wavelength kemm jista 'jkun qrib il-quċċata ta' l-eċitazzjoni għall-eċitazzjoni, u l-firxa li tirċievi teħtieġ tinkludi l-quċċata ta 'l-emissjoni. Pereżempju, il-quċċata tal-eċitazzjoni ta 'Alexa Fluor 488 hija 500nm, u l-filtru ta' eċċitazzjoni ta '480/40 jista' jintgħażel fil-mikroskopju tal-fluworexxenza.
Dettalji tal-kubi tal-filtru jistgħu jidhru fis-softwer tal-immaġini tal-mikroskopju. Il-fehim taż-żebgħa u s-sejba tal-filtru li l-aħjar jaqbel mal-kampjun tiegħek huwa kritiku għall-immaġini tal-fluworexxenza. L-informazzjoni spettrali taż-żebgħat fluworexxenti u proteini fluworexxenti hija ġeneralment indikata fl-istruzzjonijiet, u tista 'tinstab ukoll online.
Minbarra l-wavelengths ta 'eċċitazzjoni u emissjoni ta' sondi fluworexxenti, l-għażla ta 'blokki tal-filtri jeħtieġ ukoll li tikkunsidra jekk hemmx eċċitazzjoni mhux speċifika u jekk hemmx kulur inkroċjat għal kampjuni ttikkettjati b'ħafna kuluri. Barra minn hekk, huwa meħtieġ li jiġi kkunsidrat is-sors tad-dawl fluworexxenti użat. Fil-preżent, is-sorsi tad-dawl fluworexxenti użati b'mod komuni jinkludu lampi tal-merkurju, lampi tal-alid tal-metall, u sorsi tad-dawl LED li żviluppaw malajr f'dawn l-aħħar snin. L-ispettru ta 'sors tad-dawl fluworexxenti huwa kontinwu jew mhux kontinwu, u l-enerġija se tkun differenti f'meded ta' wavelength differenti. Sors tad-dawl LED gradwalment qed isir is-sors tad-dawl ewlieni tal-mikroskopju fluworexxenti minħabba l-faxxa spettrali relattivament dejqa tiegħu, produzzjoni ta 'enerġija aktar stabbli, ħajja twila, protezzjoni aktar sigura u ambjentali u ħafna vantaġġi oħra.
Minbarra l-blokka tal-filtru integrata tal-mikroskopju, hemm ukoll rota veloċi esterna (Figura 7). Il-veloċità tal-konverżjoni tal-filtru ħdejn ir-rota veloċi esterna ta 'Leica hija 27ms, li tista' tirrealizza esperimenti b'ħafna kuluri b'veloċità għolja, bħal immaġini tal-kalċju tal-proporzjon FRET u Fura2. (Fig. 8) et al.
Varjetà wiesgħa ta 'tekniki ta' immaġini ta 'mikroskopija fluworexxenti
Sabiex jintlaħqu ħtiġijiet differenti ta 'immaġini ta' fluworexxenza, minbarra mikroskopji fluworexxenti, ġew żviluppati diversi soluzzjonijiet ta 'immaġini ta' mikroskopija fluworexxenti:
Sistemi ta 'l-immaġini b'definizzjoni għolja ta' kamp wiesa ', bħal Leica THUNDER Imager, jużaw it-teknoloġija innovattiva ta' Clearing ta 'Leica biex ineħħu b'mod effiċjenti sinjali ta' interferenza tal-pjan mhux fokali waqt l-immaġini, li jippreżentaw immaġini ċari u l-vantaġġi ta 'immaġini b'veloċità għolja;
Il-mikroskopju tal-iskannjar tal-lejżer konfokali juża pinholes biex jelimina l-interferenza tal-pjan mhux fokali, jirrealizza sezzjoni ottika, u jikseb stampi ta 'definizzjoni għolja u stampi tridimensjonali;
Mikroskopji b'riżoluzzjoni ultra-għolja u nano-mikroskopji li jkissru l-limitu tad-diffrazzjoni jistgħu josservaw strutturi fini iżgħar minn 200 nm;
Sistema ta 'immaġini multiphoton li tuża l-prinċipju ta' eċitazzjoni multiphoton għall-immaġini ta 'tessut oħxon u fil-fond in vivo;
Teknoloġija ta 'l-immaġni tal-folja ħafifa b'riżoluzzjoni temporali u spazjali għolja, veloċità mgħaġġla ta' l-immaġini, riżoluzzjoni għolja, fototossiċità baxxa, speċjalment adattata għal riċerka dwar l-iżvilupp u osservazzjoni dinamika in vivo;
Immaġini tal-ħajja tal-fluworexxenza (FLIM), li mhix affettwata minn fatturi bħal konċentrazzjoni ta 'sustanza fluworexxenti, photobleaching, intensità tad-dawl ta' eċċitazzjoni, eċċ., Jista 'jwettaq kejl funzjonali u preċiż aktar fil-fond;
Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) u Fluorescence Cross Correlation Spectroscopy (FCCS), ikejlu n-numru molekulari u l-koeffiċjent tad-diffużjoni ta 'molekuli fluworexxenti, u b'hekk janalizzaw konċentrazzjoni molekulari, daqs molekulari, viskożità, moviment molekulari, rbit/dissoċjazzjoni molekulari, u proprjetajiet ottiċi molekulari;
Il-Mikroskopija ta 'Fluworexxenza ta' Riflessjoni Interna Totali (TIRF), b'riżoluzzjoni tal-assi z estremament għolja, hija ideali għall-istudju tal-istruttura molekulari u d-dinamika tal-uċuħ tal-membrana taċ-ċelluli.
