Tqabbil ta' Tekniki ta' Mikroskopija Super-Riżoluzzjoni differenti
Għall-mikroskopija tad-dawl konvenzjonali, id-diffrazzjoni tad-dawl tillimita r-riżoluzzjoni tal-immaġini għal madwar 250 nm. Illum, tekniki ta 'super-riżoluzzjoni jistgħu jtejbu dan b'aktar minn fattur ta' 10. Din it-teknika tinkiseb prinċipalment permezz ta 'tliet metodi: mikroskopija ta' lokalizzazzjoni ta 'molekula waħda, inkluż mikroskopija ta' lokalizzazzjoni fotosensittiva (PALM) u mikroskopija ta 'rikostruzzjoni ottika stochastic (STORM); mikroskopija ta' illuminazzjoni strutturata (SIM); u mikroskopija tat-tnaqqis tal-emissjonijiet stimulata (STED). Kif tagħżel teknoloġija super-riżoluzzjoni huwa dak li kulħadd jimpurtah. "Sfortunatament, m'hemm l-ebda prinċipji sempliċi biex jiġi deċiż liema metodu tuża," jgħid Mathew Stracy, riċerkatur post-dottorat fl-Università ta 'Oxford, ir-Renju Unit. "Kull wieħed għandu l-vantaġġi u l-iżvantaġġi tiegħu." Ix-xjentisti naturalment qed jidhru wkoll kif jagħżlu l-metodu t-tajjeb għal proġett partikolari. "Fil-kuntest tal-bijoimmaġini, fatturi ewlenin li għandek tikkonsidra jinkludu: riżoluzzjoni spazjali u temporali, sensittività għal fotoħsara, kapaċità ta 'tikkettar, ħxuna tal-kampjun, u fluworexxenza fl-isfond jew Fluworexxenza awtologa taċ-ċelluli." Kif taħdem Id-diversi mikroskopji super-riżoluzzjoni jaħdmu b'modi differenti. Fil-każ ta 'PALM u STORM, frazzjoni żgħira biss ta' markaturi fluworexxenti huma eċċitati jew fotoattivati f'mument partikolari, li jippermettu l-lokalizzazzjoni indipendenti tagħhom bi preċiżjoni għolja. Li tgħaddi minn dan il-proċess bit-tikketti fluworexxenti kollha tirriżulta f'immaġni sħiħa ta 'super-riżoluzzjoni. Stefan Hell, wieħed mir-rebbieħa tal-Premju Nobel fil-Kimika 2014 u direttur tal-Istitut Max Planck tal-Kimika Bijofiżika, qal: "Is-sistema PALM/STORM hija relattivament faċli biex titwaqqaf, iżda huwa diffiċli li tapplika, minħabba li l-fluworexxenti grupp għandu jkollu kapaċità ta 'fotoattivazzjoni. Limitazzjonijiet L-iżvantaġġ huwa li jeħtieġ li jiskopru molekula fluworexxenti waħda fil-kuntest ta' ċellula, u huma inqas affidabbli minn STED." STED juża polz tal-lejżer biex teċita l-fluworofor u laser f'forma ta 'ċirku biex itaffi l-fluworofor, u jħalli biss il-Fluworexxenza intermedja ta' daqs nanometru għal super-riżoluzzjoni. L-iskannjar tal-kampjun kollu jipproduċi immaġni. "Il-vantaġġ ta 'STED huwa li hija teknoloġija ta' buttuna," spjega Hell. "Taħdem bħal mikroskopju fluworexxenti konfokali standard." Jista 'wkoll immaġni ta' ċelluli ħajjin bl-użu ta 'fluworofori bħal proteini fluworexxenti ħodor jew isfar u żebgħa derivati mir-rhodamine. Tqabbil parametriku Għalkemm it-tekniki kollha ta 'super-riżoluzzjoni jaqbżu l-mikroskopija tad-dawl konvenzjonali f'termini ta' riżoluzzjoni, huma differenti minn xulxin. SIM bejn wieħed u ieħor jirdoppja r-riżoluzzjoni għal madwar 100 nm. PALM u STORM jistgħu jsolvu miri 15 nm. Skont l-Infern, STED jipprovdi riżoluzzjoni spazjali ta '30 nm f'ċelloli ħajjin u 15 nm f'ċelloli fissi. Meta niġu għal applikazzjonijiet speċifiċi, irridu nikkunsidraw ukoll il-proporzjon tas-sinjal għall-ħoss. F'xi każijiet, riżoluzzjoni aktar baxxa iżda SNR ogħla jistgħu jirriżultaw f'immaġni aħjar mill-oppost (riżoluzzjoni ogħla iżda SNR aktar baxxa). Il-veloċità tal-akkwist tal-immaġni hija wkoll importanti ħafna, speċjalment għaċ-ċelloli ħajjin. "Tekniki kollha ta 'super-riżoluzzjoni huma aktar bil-mod minn tekniki ta' immaġini ta 'fluworexxenza konvenzjonali," qal Stracy. "PALM/STORM hija l-aktar bil-mod, teħtieġ għexieren ta 'eluf ta' frejms biex tikseb immaġni waħda, SIM teħtieġ għexieren ta 'frejms, u STED hija teknoloġija tal-iskannjar, għalhekk il-veloċità tal-akkwist tiddependi fuq id-daqs tal-kamp viżiv." Minbarra ċelloli ħajjin jew ċelloli fissi ta 'Immaġini, xi xjenzati jridu jifhmu wkoll kif l-oġġetti jiċċaqilqu. Stracy huwa interessat li jifhem id-dinamika tas-sistemi bijoloġiċi fiċ-ċelloli ħajjin, mhux biss immaġini statiċi. Huwa jgħaqqad PALM ma 'traċċar ta' partiċella waħda biex janalizza d-dinamika fiċ-ċelloli ħajjin. B'dan il-mod, huwa jista 'jssegwi direttament il-molekuli markaturi hekk kif iwettqu l-funzjonijiet tagħhom. Madankollu, jemmen li SIM mhix adattata biex tistudja dawn il-proċessi dinamiċi fil-livell molekulari, iżda minħabba l-veloċità ta 'akkwist mgħaġġel tagħha, hija partikolarment adattata għall-osservazzjoni tad-dinamika ta' strutturi akbar, bħal kromożomi sħaħ. L-aħħar riżultati Fl-2017, it-tim tal-infern irrapporta l-mikroskopju super-riżoluzzjoni MINFLUX fix-Xjenza. Skont l-Infern, dan il-metodu ta 'super-riżoluzzjoni jikseb riżoluzzjoni spazjali ta' 1 nm għall-ewwel darba. Barra minn hekk, jista 'jsegwi molekuli individwali f'ċelloli ħajjin mill-inqas 100 darba aktar malajr minn metodi oħra. Xjentisti oħra tkellmu wkoll ħafna dwar il-mikroskopju MINFLUX. "Applikazzjonijiet u approċċi ġodda qed jiġu żviluppati kontinwament, iżda żewġ avvanzi jispikkaw għalija," qal Shechtman. Wieħed huwa MINFLUX. "Juża metodu inġenjuż biex tikseb pożizzjonament molekulari preċiż ħafna." Rigward it-tieni żvilupp eċċitanti, Shechtman semma WE Moerner u l-kollegi tiegħu fl-Università ta 'Stanford. Moerner kien ukoll ir-riċevitur tal-Premju Nobel għall-Kimika fl-2014. Wieħed mir-rebbieħa. Biex jindirizzaw il-limitazzjoni tar-riżoluzzjoni ta 'l-immaġini kkawżata mit-tifrix anisotropiku ta' molekuli fluworexxenti singoli, ix-xjentisti użaw polarizzazzjonijiet ta 'eċċitazzjoni differenti biex jiddeterminaw l-orjentazzjoni u l-pożizzjoni tal-molekuli. Barra minn hekk, żviluppaw uċuħ tal-istudenti delikati. Dawn it-tekniki jtejbu l-abbiltà li jiġu lokalizzati l-istrutturi. Dwar it-tikketti fluworexxenti F'ħafna applikazzjonijiet ta 'super-riżoluzzjoni, it-tikketti huma verament importanti. Hemm ukoll xi kumpaniji li jipprovdu prodotti relatati. Pereżempju, Miltenyi tal-Ġermanja ingħaqdet ma 'Abberior, kumpanija mwaqqfa minn Stefan Hell, biex tipprovdi servizzi ta' konjugazzjoni ta 'antikorpi apposta għal żebgħat ta' mikroskopija ta 'super-riżoluzzjoni. Numru ta 'kumpaniji oħra joffru wkoll markaturi tqabbil. "In-Nano-Boosters tagħna huma żgħar ħafna, 1.5 kDa biss, u speċifiċi ħafna," jgħid Christoph Eckert, uffiċjal tal-kummerċjalizzazzjoni ta 'ChromoTek. Dawn il-proteini jorbtu proteini fluworexxenti ħodor u ħomor (GFP u RFP). Huma derivati minn frammenti ta 'antikorpi tal-alpaka, magħrufa bħala VHH jew nanobodies, bi proprjetajiet ta' rbit eċċellenti u kwalità stabbli mingħajr varjazzjoni minn lott għal lott. Dawn il-markaturi huma adattati għal diversi tekniki ta 'super-riżoluzzjoni inklużi SIM, PALM, STORM u STED. Ai-Hui Tang, assistent professur fl-Università ta 'Maryland School of Medicine, u l-kollegi użaw il-GFP-Booster u STORM ta' ChromoTek biex jesploraw il-propagazzjoni tal-informazzjoni fis-sistema nervuża. Sabu nanoclusters molekulari, imsejħa nanokolonni, fin-newroni presinattiċi u postsinaptiċi. Ix-xjentisti jemmnu li din l-istruttura turi li s-sistema nervuża ċentrali timpjega prinċipji sempliċi biex iżżomm u tirregola l-effiċjenza sinaptika. Diversi verżjonijiet ta 'immaġini b'super-riżoluzzjoni u numru dejjem jikber ta' metodi qed iwasslu lix-xjenzati saħansitra aktar fil-fond fil-misteri bijoloġiċi. Billi jiksru l-limitu tad-diffrazzjoni tad-dawl viżibbli, il-bijoloġisti jistgħu saħansitra "jissorveljaw mill-qrib" l-azzjonijiet taċ-ċelloli.
