Il-mikroskopija ta 'fluworexxenza b'żewġ fotoni għandha ħafna vantaġġi:
1) Wavelengths itwal tad-dawl huma inqas affettwati mit-tifrix minn wavelengths iqsar tad-dawl biex jippenetraw il-kampjun;
(2) Il-molekuli fluworexxenti barra l-pjan fokali mhumiex eċċitati sabiex aktar dawl ta 'eċitazzjoni jista' jilħaq il-pjan fokali, sabiex id-dawl ta 'eċitazzjoni jkun jista' jippenetra aktar fil-fond fil-kampjun;
3) Wavelengths itwal ta 'dawl infra-aħmar qrib huma inqas tossiċi għaċ-ċelloli minn wavelengths iqsar;
4) Meta tuża mikroskopju b'żewġ fotoni biex tosserva kampjun, photobleaching u fototossiċità huma preżenti biss fil-pjan fokali. Għalhekk, mikroskopji b'żewġ fotoni huma aktar adattati minn mikroskopji b'foton wieħed għall-osservazzjoni ta 'kampjuni ħoxnin, għall-osservazzjoni ta' ċelloli ħajjin, jew għat-twettiq ta 'esperimenti ta' photobleaching fuq il-post.
Għarfien tal-mikroskopju fluworexxenti konfokali
Il-prinċipju bażiku tal-mikroskopju tal-fluworexxenza konfokali: sors ta 'dawl punt huwa użat biex irradja l-kampjun, li jifforma punt ta' dawl żgħir u definit tajjeb fuq il-pjan fokali. Il-fluworexxenza emessa minn dan il-punt wara l-irradjazzjoni tinġabar mil-lenti oġġettiva u tintbagħat lura lill-beamsplitter li jikkonsisti minn mera kromatika bi-direzzjonali tul il-mogħdija tad-dawl tal-irradjazzjoni oriġinali. Ir-raġġ splitter jibgħat il-fluworexxenza direttament lid-ditekter. Kemm is-sors tad-dawl kif ukoll id-ditekter għandhom kull wieħed pinhole quddiemhom, imsejħa pinhole tal-illuminazzjoni u pinhole ta 'skoperta, rispettivament. It-tnejn għandhom l-istess ġeometrija, madwar 100-200 nm, u huma konjugati fir-rigward tal-punt tad-dawl fuq il-pjan fokali, jiġifieri, il-punt tad-dawl jgħaddi minn serje ta’ lentijiet u fl-aħħar mill-aħħar jistgħu jiġu ffukati kemm fuq il-punt li jdawwal. u pinholes detector. B'dan il-mod, id-dawl mill-pjan fokali jista 'jikkonverġi fi ħdan l-apertura tas-sonda, filwaqt li dawl imxerred minn fuq jew taħt il-pjan fokali huwa mblukkat barra l-apertura tas-sonda u ma jistax jiġi immaġni. Il-laser jiskenja l-kampjun punt b'punt, u t-tubu fotomultiplikatur wara li jiskopri l-pinhole jikseb ukoll l-immaġni konfokali tal-punt tad-dawl korrispondenti punt b'punt, li huwa kkonvertit f'sinjal diġitali u trażmess lill-kompjuter, u finalment jikkonverġi f'ċar ċar. immaġni konfokali tal-pjan fokali kollu fuq l-iskrin.
Kull immaġni tal-pjan fokali hija fil-fatt cross-section ottika tal-kampjun, u din is-sezzjoni trasversali ottika dejjem għandha ċerta ħxuna, magħrufa wkoll bħala folja ottika. Peress li l-intensità tad-dawl fil-punt fokali hija ħafna akbar minn dik fil-punt mhux fokali, u d-dawl tal-pjan mhux fokali jiġi ffiltrat mill-pinhole, il-fond tal-kamp tas-sistema confocal huwa approssimat li jkun żero, u l-iskannjar tul id-direzzjoni tal-assi Z tippermetti li t-tomografija ottika tifforma porzjon ottiku bidimensjonali tal-kampjun li għandu jiġi osservat fil-post fokali. Li tgħaqqad l-iskannjar tal-pjan XY (pjan fokali) ma 'l-iskannjar tal-assi Z (assi ottiku), tista' tinkiseb immaġni tridimensjonali tal-kampjun billi jakkumulaw saffi suċċessivi ta 'immaġini bidimensjonali, li huma pproċessati minn softwer tal-kompjuter speċjalizzat.
Dan ifisser li l-pinhole tas-sejbien u l-pinhole tas-sors tad-dawl huma dejjem iffukati fl-istess punt, sabiex il-fluworexxenza eċċitati barra l-pjan fokali ma tistax tidħol fil-pinhole ta 'skoperta.
Il-prinċipju ta 'ħidma tal-laser confocal huwa sempliċement espress li juża l-laser bħala sors tad-dawl, fuq il-bażi ta' immaġini ta 'mikroskopju fluworexxenti tradizzjonali, apparat ta' skannjar tal-lejżer addizzjonali u apparat li jiffoka konjugat, permezz ta 'kontroll tal-kompjuter biex iwettaq akkwist ta' immaġini diġitali u sistema ta 'proċessar.
