Hemm ħafna vantaġġi għall-mikroskopija ta 'fluworexxenza b'żewġ fotoni
1) Id-dawl ta 'tul ta' mewġ twil huwa inqas affettwat mit-tifrix minn dawl ta 'tul ta' mewġ qasir u jista 'faċilment jippenetra l-kampjun;
2) Molekuli fluworexxenti barra l-pjan fokali mhumiex eċċitati, li jippermettu li aktar dawl ta 'eċċitazzjoni jilħaq il-pjan fokali, li jippermetti li d-dawl ta' eċċitazzjoni jippenetra kampjuni aktar profondi;
3) Dawl qrib infra-aħmar ta 'tul ta' mewġ twil huwa inqas tossiku għaċ-ċelloli minn dawl ta 'tul ta' mewġ qasir;
4) Meta jiġu osservati kampjuni bl-użu ta 'mikroskopju b'żewġ fotoni, photobleaching u fototossiċità jseħħu biss fuq il-pjan fokali. Għalhekk, mikroskopji b'żewġ fotoni huma aktar adattati minn mikroskopji b'foton wieħed għall-osservazzjoni ta 'kampjuni ħoxnin, għall-osservazzjoni ta' ċelloli ħajjin, jew biex iwettqu esperimenti ta 'photobleaching f'punt fiss.
Għarfien dwar mikroskopija fluworexxenti konfokali
Il-prinċipju bażiku tal-mikroskopija tal-fluworexxenza konfokali: Uża sors tad-dawl punt biex iddawwal il-kampjun biex tifforma post tad-dawl żgħir u definit tajjeb fuq il-pjan fokali. Il-fluworexxenza emessa mill-post wara li tkun illuminata tinġabar mil-lenti oġġettiva u terġa 'lura lejn il-mera dikrojka tul il-mogħdija tad-dawl ta' illuminazzjoni oriġinali. jikkostitwixxu splitter tar-raġġ. L-ispettrometru jibgħat il-fluworexxenza direttament lid-ditekter. Hemm pinhole quddiem is-sors tad-dawl u d-ditekter, li jissejħu l-pinhole ta 'l-illuminazzjoni u l-pinhole ta' skoperta rispettivament. Id-dimensjonijiet ġeometriċi tat-tnejn huma konsistenti, madwar 100-200nm; relattiv għall-punt tad-dawl fuq il-pjan fokali, it-tnejn huma konjugati, jiġifieri, il-punt tad-dawl jgħaddi minn serje ta 'lentijiet u fl-aħħar mill-aħħar jista' jkun iffukat fuq il-pinhole tal-illuminazzjoni u l-pinhole ta 'skoperta fl-istess ħin. B'dan il-mod, id-dawl mill-pjan fokali jista 'jiġi kkonċentrat fit-toqba ta' skoperta, filwaqt li d-dawl imxerred minn fuq jew taħt il-pjan fokali huwa mblukkat barra mit-toqba ta 'skoperta u ma jistax jiġi immaġinat. Il-kampjun jiġi skennjat punt b'punt bil-lejżer, u t-tubu fotomultiplikatur wara l-pinhole ta 'skoperta jikseb ukoll l-immaġni konfokali tal-punt tad-dawl korrispondenti punt b'punt, li jiġi kkonvertit f'sinjal diġitali u trasmess lill-kompjuter, u finalment jiġi aggregat fuq l-iskrin f'immaġni konfokali ċara tal-pjan fokali kollu. .
Kull immaġni tal-pjan fokali hija fil-fatt cross-section ottika tal-kampjun. Din is-sezzjoni trasversali ottika dejjem għandha ċerta ħxuna u tissejjaħ ukoll sezzjoni rqiqa ottika. Peress li l-intensità tad-dawl fil-fokus hija ħafna akbar mill-intensità tad-dawl fin-nuqqas ta 'fokus, u d-dawl tal-pjan mhux fokali huwa ffiltrat mill-pinhole, il-fond tal-kamp tas-sistema confocal huwa bejn wieħed u ieħor żero. L-iskannjar tul id-direzzjoni tal-assi Z jista 'jirrealizza tomografija ottika, li jiffurmaw il-mixtieqa Osserva s-sezzjoni ottika bidimensjonali fil-post iffukat tal-kampjun. Billi tgħaqqad l-iskannjar tal-pjan XY (pjan fokali) ma 'l-iskannjar ta' l-assi Z (assi ottiku), billi jakkumula livelli kontinwi ta 'immaġini bidimensjonali u tipproċessahom b'softwer tal-kompjuter speċjalizzat, tista' tinkiseb immaġni tridimensjonali tal-kampjun.
Jiġifieri, il-pinhole ta 'skoperta u l-pinhole tas-sors tad-dawl huma dejjem iffukati fuq l-istess punt, sabiex il-fluworexxenza eċċitati barra l-pjan tal-fokus ma tistax tidħol fil-pinhole ta' skoperta.
L-espressjoni sempliċi tal-prinċipju tax-xogħol tal-laser confocal hija li juża l-laser bħala s-sors tad-dawl. Fuq il-bażi tal-immaġni tal-mikroskopju fluworexxenti tradizzjonali, jiżdiedu apparat ta 'skannjar bil-lejżer u apparat li jiffoka konjugat, u s-sistema hija kkontrollata minn kompjuter biex tiġbor u tipproċessa immaġini diġitali.
