Immaġini ta 'mikroskopija multifoton: tekniki varji għall-immaġini tan-newroni in vivo
Meta mqabbel mal-mikroskopju fluworexxenti ta 'kamp wiesa' b'foton wieħed tradizzjonali, il-mikroskopija multifoton (MPM) għandha l-funzjonijiet ta 'sezzjoni ottika u immaġni fil-fond. Fl-2019, Jerome Lecoq et al. iddiskuta teknoloġija MPM relatata minn tliet aspetti: immaġni tan-newroni fil-fond fil-moħħ, immaġni tan-newroni massiva, u immaġni tan-newroni b'veloċità għolja.
Sabiex tgħaqqad l-attività tan-newroni ma 'imġieba kumplessa, ġeneralment ikun meħtieġ li n-newroni jiġu immaġinati fil-kortiċi fil-fond, li jeħtieġ li l-MPM ikollu l-abbiltà ta' immaġni fil-fond. Id-dawl ta 'eċċitazzjoni u emissjoni se jkun imxerred ħafna u assorbit minn tessut bijoloġiku, li huwa l-fattur ewlieni li jillimita l-fond ta' l-immaġini ta 'MPM. Għalkemm il-problema tat-tifrix tista 'tiġi solvuta billi tiżdied l-intensità tal-lejżer, se ġġib problemi oħra, bħal ħruq tal-kampjun, defocusing u eċċitazzjoni fluworexxenti qrib il-wiċċ. L-aħjar mod biex tiżdied il-fond tal-immaġini MPM huwa li tuża wavelengths itwal bħala dawl ta 'eċitazzjoni.
Barra minn hekk, għal immaġini b'żewġ fotoni (2P), eċċitazzjoni ta 'fluworexxenza barra mill-fokus u qrib il-wiċċ huma l-akbar żewġ fatturi li jillimitaw il-fond, filwaqt li għal immaġini bi tliet fotoni (3P), dawn iż-żewġ problemi jitnaqqsu ħafna, iżda immaġini ta 'tliet fotoni minħabba fluworexxenza Is-sezzjoni trasversali ta' assorbiment tal-grupp hija ħafna iżgħar minn dik ta '2P, għalhekk ordni ta' enerġija tal-polz ogħla hija meħtieġa biex tikseb l-istess sinjal ta 'fluworexxenza ta' intensità bħal dik eċċitata minn 2P. Il-mikroskopija 3P funzjonali hija aktar impenjattiva minn mikroskopija 3P strutturali, li teħtieġ skanjar aktar mgħaġġel sabiex tieħu kampjun ta 'attività newronali fil-ħin; enerġija tal-polz ogħla hija meħtieġa sabiex jinġabru sinjali suffiċjenti fil-ħin ta 'dwell ta' kull pixel.
Imgieba kumplessi ħafna drabi jinvolvu netwerks kbar tal-moħħ b'konnessjonijiet kemm lokali kif ukoll fuq medda twila. Biex torbot l-attività tan-newroni mal-imġieba, huwa meħtieġ li tissorvelja l-attività ta 'newroni kbar ħafna u mqassma b'mod wiesa' fl-istess ħin. In-netwerk newrali fil-moħħ jipproċessa stimuli deħlin fi żmien għexieren ta 'millisekondi. Biex tifhem dan in-netwerk newrali veloċi Biex tistudja d-dinamika tan-newroni, MPM huwa meħtieġ li jkollu l-abbiltà li jiġbed malajr in-newroni. Metodi MPM veloċi jistgħu jinqasmu f'tekniki ta 'skanjar b'raġġ wieħed u tekniki ta' skanjar b'ħafna raġġ.
It-teknoloġija tal-iskannjar b'raġġ wieħed tippermetti traversali b'veloċità għolja tat-tessut newrali b'kamp viżiv kbir (FOV)
Meta tuża MPM għal immaġni newroni, skanjar b'aċċess każwali—jiġifieri, ir-raġġ tal-lejżer jiġi skennjat malajr fi kwalunkwe punt magħżul fuq il-kamp viżiv kollu—jista 'skannja biss in-newroni ta' interess, li mhux biss jevita l-iskannjar ta 'kwalunkwe fibri tan-nervituri mhux tikkettati jistgħu. jottimizza wkoll il-ħin tal-iskannjar tar-raġġ tal-lejżer. Skanjar b'aċċess każwali (Fig. 1) jista 'jinkiseb b'deflector akusto-ottiku (AOD), li jaħdem billi jgħaqqad transducer pjeżoelettriku b'sinjal ta' frekwenza tar-radju ma 'kristall adattat. Il-mewġ akustiku li jirriżulta jinduċi ħakk ta 'indiċi rifrattiv perjodiku, Id-diffrazzjoni sseħħ meta raġġ tal-lejżer jgħaddi minn gradilja. L-intensità u l-frekwenza tal-mewġ tal-ħoss jistgħu jiġu aġġustati bis-sinjal elettriku tal-frekwenza tar-radju biex jibdlu l-intensità u d-direzzjoni tad-dawl diffrattat, sabiex l-iskannjar ta 'punt arbitrarju orizzontali b'dimensjoni waħda jista' jiġi realizzat bl-użu ta 'AOD wieħed, u 3D jista' jiġi realizzat billi tuża par ta 'AODs flimkien ma' teknoloġiji oħra ta 'skanjar axjali skanjar b'aċċess każwali. Madankollu, din it-teknika hija sensittiva ħafna għall-moviment tal-kampjun u suxxettibbli għall-artifacts tal-moviment. Fil-preżent, skanjar raster veloċi, jiġifieri, skanjar progressiv f'FOV, huwa użat ħafna minħabba li l-algoritmu jista 'faċilment isolvi l-artifacts tal-moviment.
Immaġini b'żewġ fotoni bbażati fuq AOD ta 'newroni L2/3 neokortikali in vivo[2]
Hemm ħafna modi biex tirrealizza skannjar raster mgħaġġel, billi tuża mera li tivvibra għal skanjar 2D mgħaġġel, li tgħaqqad mera li tivvibra u lenti elettrika aġġustabbli għal skannjar 3D mgħaġġel, iżda l-lenti elettrika aġġustabbli ma tistax tiffoka malajr fid-direzzjoni axjali minħabba l-limitazzjoni ta ' inerzja mekkanika Il-bidla, li taffettwa l-veloċità tal-immaġini, issa tista 'tiġi sostitwita b'modulatur tad-dawl spazjali (SLM).
L-iffukar mill-bogħod huwa wkoll mezz biex tinkiseb immaġini 3D, kif muri fil-Figura 2. Fil-modulu LSU, il-galvanometru tal-iskannjar jiskenja orizzontalment, u l-modulu ASU jinkludi l-lenti oġġettiva L1 u l-mera M, u l-iskannjar axjali huwa realizzat billi jiġi aġġustat il-pożizzjoni ta 'M. Din it-teknika tista' mhux biss tikkoreġi l-aberrazzjoni ottika introdotta mill-lenti ta 'l-objettiv ewlieni L2, iżda wkoll tippermetti skanjar axjali veloċi. Biex tikseb aktar immaġini tan-newroni, il-FOV jista 'jitkabbar billi jiġi aġġustat id-disinn tal-lenti oġġettiva tal-mikroskopju, iżda l-lenti oġġettiva b'NA kbira u FOV kbir hija ġeneralment tqila u ma tistax tiċċaqlaq malajr għal skanjar axjali veloċi, għalhekk is-sistemi FOV kbar jiddependu fuq Telefocus , SLM u lentijiet motorizzati aġġustabbli.
Dijagramma skematika ta’ sistema ta’ immaġini b’żewġ fotoni li tiffoka remot[3] It-teknoloġija ta’ skannjar b’ħafna raġġi tista’ fl-istess ħin immaġni ta’ pożizzjonijiet differenti ta’ tessut newronali
This technique3 typically uses two independent paths for imaging two distant (>1-2 mm bogħod minn xulxin) siti tal-immaġini (Fig. 3C,D); għal reġjuni ħdejn xulxin, normalment juża raġġi multipli ta 'lenti oġġettiva waħda għall-immaġini (Fig. 3E, F). It-teknika ta 'skannjar b'ħafna raġġi trid tagħti attenzjoni speċjali lill-problema tal-crosstalk bejn ir-raġġi ta' eċċitazzjoni, li tista 'tiġi solvuta permezz ta' metodu ta 'separazzjoni ta' sors ta 'wara tad-dawl jew metodu ta' multiplexing spazjali-ħin. Il-metodu ta 'separazzjoni tas-sors tad-dawl post-hoc jirreferi għall-użu ta' algoritmi biex jisseparaw ir-raġġi biex jeliminaw il-crosstalk; il-metodu tal-multiplexing tal-ispazju tal-ħin jirreferi għall-użu simultanju ta 'raġġi ta' eċċitazzjoni multipli, il-impulsi ta 'kull raġġ jittardjaw fiż-żmien, sabiex ir-raġġi individwali eċċitati minn travi differenti jistgħu jiġu separati temporanjament. sinjal fluworexxenti. Aktar newroni jistgħu jiġu immaġini billi jiġu introdotti aktar raġġi, iżda raġġi multipli se jżidu l-koinċidenza tal-ħin tat-tħassir tal-fluworexxenza, li jillimita l-abbiltà li tiddistingwi s-sorsi tas-sinjali; u l-multiplexing għandu impatt negattiv fuq il-veloċità tax-xogħol ta 'apparat elettroniku. Rekwiżiti għoljin; numru kbir ta 'raġġi jeħtieġ ukoll qawwa ogħla tal-lejżer biex jinżamm proporzjon bejn is-sinjal u l-ħoss ta' raġġ wieħed, li jista 'faċilment iwassal għal ħsara fit-tessut.
Teknoloġija ta 'Immaġini ta' Żona Kbira
F'dawn l-aħħar snin, l-iżvilupp ta 'teknoloġiji MPM differenti wessa' l-ambitu tal-immaġini tagħna tat-tessut newrali, u b'hekk inkunu nistgħu nixbgħu aktar newroni fil-fond fil-moħħ b'veloċità aktar mgħaġġla, li ppromwoviet ħafna r-riċerka fin-newroxjenza u ppermettietna niksbu fehim aktar ċar. tal-funzjoni tal-moħħ.
