Il-mikroskopija tal-fluworexxenza hija differenti mill-mikroskopija konvenzjonali
Mikroskopji fluworexxenti jużaw dawl ultravjola bħala sors tad-dawl biex irradjaw l-oġġett li għandu jiġi spezzjonat, sabiex l-oġġett jarmi d-dawl, u mbagħad josserva l-oġġett taħt il-mikroskopju. Jintuża prinċipalment għal ċelluli immunofluworexxenti. Huwa magħmul prinċipalment minn sors tad-dawl, sistema ta 'pjanċa tal-filtru u sistema ottika biex tosserva l-immaġni fluworexxenti tal-kampjun permezz tal-ingrandiment tal-ocular u lenti oġġettiva. Ejja nagħtu ħarsa lejn id-differenza bejn dan il-mikroskopju fluworexxenti u mikroskopju ottiku ordinarju.
1. Ħares lejn il-metodu tad-dawl
Il-metodu ta 'illuminazzjoni tal-mikroskopju fluworexxenti huwa ġeneralment episkopiku, jiġifieri, is-sors tad-dawl huwa proġettat fuq il-kampjun tat-test permezz tal-lenti oġġettiva.
2. Ħares lejn ir-riżoluzzjoni
Mikroskopji fluworexxenti jużaw dawl ultravjola bħala sors tad-dawl, u l-wavelength huwa relattivament qasir, iżda r-riżoluzzjoni hija ogħla minn dik ta 'mikroskopji ottiċi ordinarji.
3. Id-differenza fil-filtru
Il-mikroskopji tal-fluworexxenza jużaw żewġ filtri speċjali, li jintużaw quddiem is-sors tad-dawl biex jiffiltraw id-dawl viżibbli, u jintużaw bejn il-lenti oġġettiva u l-ocular biex jiffiltraw ir-raġġi ultravjola, li jistgħu jipproteġu l-għajnejn tal-bniedem.
Mikroskopju fluworexxenti huwa wkoll tip ta 'mikroskopju ottiku, prinċipalment minħabba li l-wavelength eċċitati mill-mikroskopju fluworexxenti huwa qasir, għalhekk dan iwassal għad-differenza fl-istruttura u l-użu bejn il-mikroskopju fluworexxenti u l-mikroskopju ordinarju. Ħafna mill-mikroskopji fluworexxenti għandhom funzjoni tajba li jaqbdu dawl dgħajjef, għalhekk taħt fluworexxenza estremament dgħajfa, il-kapaċità ta 'l-immaġini tagħha hija wkoll tajba. Flimkien mat-titjib kontinwu tal-mikroskopji fluworexxenti f'dawn l-aħħar snin, il-ħoss ukoll tnaqqas ħafna. Għalhekk aktar u aktar mikroskopji fluworexxenti huma użati.
par
Għarfien dwar Photon Fluorescence Microscopy
Il-prinċipju bażiku ta 'eċitazzjoni b'żewġ fotoni huwa: fil-każ ta' densità għolja ta 'fotoni, molekuli fluworexxenti jistgħu jassorbu żewġ fotoni ta' tul ta 'mewġ twil fl-istess ħin, u jarmu foton ta' tul ta 'mewġ iqsar wara ħajja qasira tal-hekk imsejħa stat eċċitati; l-effett huwa l-istess bħall-użu ta 'foton b'nofs wavelength tal-wavelength twil biex teċita molekuli fluworexxenti. Eċitazzjoni ta 'żewġ fotoni teħtieġ densità għolja ta' fotoni. Sabiex ma ssirx ħsara liċ-ċelloli, il-mikroskopija b'żewġ fotoni tuża lejżers pulsati b'mod ta 'enerġija għolja msakkra. Il-lejżer emess minn dan il-laser għandu enerġija massima għolja u enerġija medja baxxa, il-wisa 'tal-polz tiegħu hija biss 100 femtoseconds, u l-frekwenza tagħha tista' tilħaq 80 sa 100 megahertz. Meta tuża lenti oġġettiva b'apertura numerika għolja biex tiffoka l-fotoni tal-laser pulsat, id-densità tal-fotoni fil-punt fokali tal-lenti oġġettiva hija l-ogħla, u l-eċitazzjoni b'żewġ fotoni sseħħ biss fil-punt fokali tal-lenti oġġettiva, għalhekk il- mikroskopju b'żewġ fotoni ma jeħtieġx pinhole konfokali, li jtejjeb l-effiċjenza ta 'skoperta tal-fluworexxenza.
F'fenomeni ta 'fluworexxenza ġenerali, minħabba d-densità baxxa tal-foton tad-dawl ta' eċċitazzjoni, molekula fluworexxenti tista 'biss tassorbi foton wieħed fl-istess ħin, u mbagħad temetti foton fluworexxenti permezz ta' transizzjoni radjattiva, li hija fluworexxenza ta 'foton wieħed. Għall-proċess ta 'eċitazzjoni tal-fluworexxenza bl-użu tal-laser bħala s-sors tad-dawl, jista' jseħħ fluworexxenza b'żewġ fotoni jew saħansitra multi-fotoni. F'dan iż-żmien, l-intensità tas-sors tad-dawl ta 'eċitazzjoni użat hija għolja, u d-densità tal-fotoni tissodisfa r-rekwiżiti ta' molekuli fluworexxenti li jassorbu żewġ fotoni fl-istess ħin. Fil-proċess ta 'użu ta' laser ġenerali bħala s-sors tad-dawl ta 'eċitazzjoni, id-densità tal-fotoni għadha mhix biżżejjed biex tipproduċi l-fenomenu ta' assorbiment ta 'żewġ fotoni. Normalment, jintuża lejżer pulsat femtosecond, u l-qawwa istantanja tiegħu tista 'tilħaq l-ordni ta' megawatts. Għalhekk, il-wavelength tal-fluworexxenza b'żewġ fotoni huwa iqsar mill-wavelength tad-dawl ta 'eċitazzjoni, li huwa ekwivalenti għall-effett prodott mill-eċitazzjoni f'nofs il-wavelength ta' eċċitazzjoni.
Il-mikroskopija tal-fluworexxenza b'żewġ fotoni għandha ħafna vantaġġi:
1) Id-dawl ta 'tul ta' mewġ twil huwa inqas affettwat mit-tifrix minn dawl ta 'tul ta' mewġ qasir u faċilment jippenetra l-kampjun;
2) Il-molekuli fluworexxenti barra l-pjan fokali mhumiex eċċitati, sabiex aktar dawl ta 'eċitazzjoni jista' jilħaq il-pjan fokali, sabiex id-dawl ta 'eċitazzjoni jkun jista' jippenetra kampjuni aktar profondi;
3) Dawl qrib infra-aħmar ta 'tul ta' mewġ twil huwa inqas tossiku għaċ-ċelloli minn dawl ta 'tul ta' mewġ qasir;
4) Meta tuża mikroskopju b'żewġ fotoni biex tosserva kampjuni, photobleaching u fototossiċità jseħħu biss fil-pjan fokali. Għalhekk, mikroskopija b'żewġ fotoni hija aktar adattata minn mikroskopija b'foton wieħed għall-osservazzjoni ta 'kampjuni ħoxnin, għall-osservazzjoni ta' ċelloli ħajjin, jew għal esperimenti ta 'photobleaching fuq il-post.
Għarfien dwar mikroskopija fluworexxenti konfokali
Il-prinċipju bażiku tal-mikroskopija tal-fluworexxenza konfokali: il-kampjun huwa irradjat minn sors ta 'dawl punt, u post tad-dawl żgħir u definit tajjeb huwa ffurmat fuq il-pjan fokali. Wara li l-punt jiġi irradjat, il-fluworexxenza emessa tinġabar mil-lenti oġġettiva u tintbagħat lura lill-isplitter tar-raġġ magħmul minn mera dikroika tul il-mogħdija ta 'illuminazzjoni oriġinali. Ir-raġġ splitter jibgħat il-fluworexxenza direttament lid-ditekter. Hemm pinhole quddiem is-sors tad-dawl u d-ditekter, rispettivament imsejjaħ pinhole tal-illuminazzjoni u pinhole ta 'skoperta. Id-daqs ġeometriku tat-tnejn huwa l-istess, madwar 100-200nm; relattiv għall-post tad-dawl fuq il-pjan fokali, it-tnejn huma konjugati, jiġifieri, il-post tad-dawl jgħaddi minn serje ta 'lentijiet, u finalment jista' jiġi ffukat fuq il-pinhole tal-illuminazzjoni u l-pinhole ta 'skoperta fl-istess ħin. B'dan il-mod, id-dawl mill-pjan fokali jista 'jiġi konverġenti fl-ambitu tat-toqba ta' skoperta, filwaqt li d-dawl imxerred minn fuq jew taħt il-pjan fokali huwa mblukkat barra mit-toqba ta 'skoperta u ma jistax jiġi immaġni. Il-laser jiskenja l-kampjun punt b'punt, u t-tubu fotomultiplikatur wara li jiskopri l-pinhole jikseb ukoll l-immaġni konfokali tal-punt tad-dawl korrispondenti punt b'punt, li huwa kkonvertit f'sinjal diġitali u trasmess lill-kompjuter, u finalment aggregat f'ċar ċar. immaġni konfokali tal-pjan fokali kollu fuq l-iskrin.
Kull immaġni tal-pjan fokali hija fil-fatt cross-section ottika tal-kampjun, u din is-sezzjoni trasversali ottika dejjem għandha ċerta ħxuna, magħrufa wkoll bħala sezzjoni rqiqa ottika. Peress li l-intensità tad-dawl fil-punt fokali hija ħafna akbar minn dik fil-punt mhux fokali, u d-dawl tal-pjan mhux fokali jiġi ffiltrat mill-pinhole, il-fond tal-kamp tas-sistema confocal huwa bejn wieħed u ieħor żero, u l-iskannjar tul il- L-assi Z jistgħu jirrealizzaw tomografija ottika, li jiffurmaw porzjon ottiku bidimensjonali fil-post iffukat tal-kampjun li għandu jiġi osservat. Li tgħaqqad l-iskannjar tal-pjan XY (pjan fokali) ma 'l-iskannjar tal-assi Z (assi ottiku), l-immaġni tridimensjonali tal-kampjun tista' tinkiseb billi jakkumulaw immaġini bidimensjonali ta 'saffi kontinwi u pproċessati b'softwer tal-kompjuter speċjali.
Jiġifieri, il-pinhole tas-sejbien u l-pinhole tas-sors tad-dawl huma dejjem iffukati fuq l-istess punt, sabiex il-fluworexxenza eċċitati barra l-pjan fokali ma tistax tidħol fil-pinhole ta 'skoperta.
L-espressjoni sempliċi tal-prinċipju tax-xogħol tal-laser confocal hija li juża d-dawl tal-lejżer bħala s-sors tad-dawl. Fuq il-bażi ta 'l-immaġini tradizzjonali tal-mikroskopju fluworexxenti, iżid apparat ta' skannjar bil-lejżer u apparat li jiffoka konjugat, u hija sistema għall-akkwist u l-ipproċessar ta 'immaġni diġitali permezz ta' kontroll tal-kompjuter.
