Differenza Bejn Mikroskopju Fluworexxenti u Mikroskopju Normali
1. Ħares lejn il-metodu tad-dawl
Il-metodu ta 'illuminazzjoni tal-mikroskopju fluworexxenti huwa ġeneralment epi-tip, jiġifieri, is-sors tad-dawl jitqiegħed fuq il-kampjun tat-test permezz tal-lenti oġġettiva.
2. Ħares lejn ir-riżoluzzjoni
Mikroskopji fluworexxenti jużaw dawl ultravjola bħala s-sors tad-dawl, b'wavelength relattivament qasir, iżda r-riżoluzzjoni hija ogħla minn dik ta 'mikroskopji ottiċi ordinarji.
3, id-differenza fil-filtru
Mikroskopju ta 'fluworexxenza juża żewġ filtri speċjali, użati quddiem is-sors tad-dawl biex jiffiltraw id-dawl viżibbli, u użati bejn il-lenti oġġettiva u l-ocular biex jiffiltraw id-dawl ultravjola, li jista' jipproteġi l-għajnejn tal-bniedem.
Mikroskopju fluworexxenti huwa wkoll tip ta 'mikroskopju ottiku, prinċipalment minħabba li l-wavelength eċċitati mill-mikroskopju fluworexxenti huwa qasir, għalhekk dan iwassal għad-differenza fl-istruttura u l-użu tal-mikroskopju fluworexxenti u l-mikroskopju ordinarju. Ħafna mill-mikroskopji fluworexxenti għandhom funzjoni tajba li jaqbdu dawl dgħajjef. , għalhekk taħt fluworexxenza estremament dgħajfa, il-kapaċità tal-immaġini tagħha hija wkoll tajba. Flimkien mat-titjib kontinwu tal-mikroskopija tal-fluworexxenza f'dawn l-aħħar snin, l-istorbju wkoll tnaqqas ħafna. Għalhekk, aktar u aktar mikroskopji fluworexxenti huma użati.
Għarfien tal-Mikroskopija ta' Fluworexxenza b'żewġ Fotoni
Il-prinċipju bażiku ta 'eċitazzjoni b'żewġ fotoni huwa: fil-każ ta' densità għolja ta 'fotoni, molekuli fluworexxenti jistgħu jassorbu żewġ fotoni ta' tul ta 'mewġ twil fl-istess ħin, u wara ħajja qasira ħafna ta' l-hekk imsejħa ħajja ta 'stat eċċitati, jarmu foton ta' tul ta 'mewġ qasir. ; l-effett huwa l-istess bħall-użu ta 'foton b'wavelength nofs il-wavelength twil biex teċita molekula fluworexxenti. Eċitazzjoni b'żewġ fotoni teħtieġ densità għolja ta 'fotoni, u sabiex ma ssirx ħsara liċ-ċelloli, mikroskopija b'żewġ fotoni tuża lejżers pulsati b'mod ta' enerġija għolja msakkra. Dan il-lejżer jarmi dawl tal-lejżer b'enerġija massima għolja u enerġija medja baxxa, b'wisa 'tal-polz ta' 100 femtoseconds biss u frekwenza ta '80 sa 100 MHz. Meta lenti oġġettiva b'apertura numerika għolja tintuża biex tiffoka l-fotoni tal-laser pulsat, id-densità tal-fotoni fil-punt fokali tal-lenti oġġettiva hija l-ogħla, u l-eċitazzjoni b'żewġ fotoni sseħħ biss fil-punt fokali tal-lenti oġġettiva, għalhekk il-mikroskopju b'żewġ fotoni m'għandux bżonn pinhole konfokali, li jtejjeb l-effiċjenza ta 'skoperta tal-Fluworexxenza.
Fil-fenomenu tal-fluworexxenza ġenerali, minħabba d-densità baxxa tal-foton tad-dawl ta 'eċitazzjoni, molekula fluworexxenti tista' biss tassorbi foton wieħed fl-istess ħin, u mbagħad temetti foton fluworexxenti permezz tat-tranżizzjoni tar-radjazzjoni, li tissejjaħ fluworexxenza ta 'foton wieħed. Għall-proċess ta 'eċitazzjoni tal-fluworexxenza bil-laser bħala s-sors tad-dawl, jista' jseħħ fenomenu ta 'fluworexxenza b'żewġ fotoni jew saħansitra multi-fotoni. F'dan iż-żmien, l-intensità tas-sors tad-dawl ta 'eċitazzjoni użat hija għolja, u d-densità tal-fotoni tissodisfa r-rekwiżit li l-molekula fluworexxenti tassorbi żewġ fotoni fl-istess ħin. Fil-proċess ta 'użu ta' laser ġenerali bħala s-sors tad-dawl ta 'eċitazzjoni, id-densità tal-fotoni għadha mhix biżżejjed biex tipproduċi assorbiment ta' żewġ fotoni. Normalment, jintuża lejżer impulsat femtosecond, u l-qawwa istantanja tiegħu tista 'tilħaq l-ordni ta' megawatts. Għalhekk, il-wavelength tal-fluworexxenza b'żewġ fotoni huwa iqsar mill-wavelength tad-dawl ta 'eċitazzjoni, li huwa ekwivalenti għall-effett prodott mill-eċitazzjoni tal-wavelength ta' nofs eċitazzjoni.
Il-mikroskopija tal-fluworexxenza b'żewġ fotoni għandha ħafna vantaġġi:
1) Id-dawl ta 'tul ta' mewġ twil huwa inqas affettwat mit-tifrix minn dawl ta 'tul ta' mewġ qasir u jista 'faċilment jippenetra l-kampjun;
2) Il-molekuli fluworexxenti barra l-pjan fokali mhumiex eċċitati, sabiex aktar dawl ta 'eċitazzjoni jista' jilħaq il-pjan fokali, sabiex id-dawl ta 'eċitazzjoni jkun jista' jippenetra kampjuni aktar profondi;
3) Dawl qrib infra-aħmar ta 'tul ta' mewġ twil huwa inqas tossiku għaċ-ċelloli minn dawl ta 'tul ta' mewġ qasir;
4) Meta tara kampjuni b'mikroskopija b'żewġ fotoni, photobleaching u fototossiċità huma preżenti biss fil-pjan fokali. Għalhekk, mikroskopija b'żewġ fotoni hija aktar adattata biex tara kampjuni ħoxnin minn mikroskopija b'foton wieħed, biex tara ċelloli ħajjin, jew biex twettaq esperimenti ta 'photobleaching f'punt fiss.
Għarfien tal-mikroskopija tal-fluworexxenza konfokali
Il-prinċipju bażiku tal-mikroskopija tal-fluworexxenza konfokali: bl-użu ta 'sors ta' dawl punt biex idawwal il-kampjun, huwa ffurmat post tad-dawl żgħir b'kontorn definit tajjeb fuq il-pjan fokali. kostitwit mill-isplitter tar-raġġ. Ir-raġġ splitter jibgħat il-fluworexxenza direttament lid-ditekter. Hemm pinhole quddiem is-sors tad-dawl u d-ditekter, rispettivament imsejjaħ pinhole tal-illuminazzjoni u pinhole ta 'skoperta. Id-dimensjonijiet ġeometriċi tat-tnejn huma l-istess, madwar 100-200 nm; relattiv għall-post tad-dawl fuq il-pjan fokali, it-tnejn huma konjugati, jiġifieri, il-post tad-dawl jgħaddi minn serje ta 'lentijiet, u finalment jista' jiġi ffukat fuq il-pinhole tal-illuminazzjoni u l-pinhole ta 'skoperta fl-istess ħin. B'dan il-mod, id-dawl mill-pjan fokali jista 'jiġi kkonċentrat fil-medda tat-toqba ta' skoperta, filwaqt li d-dawl imxerred minn fuq jew taħt il-pjan fokali huwa mblukkat mit-toqba ta 'skoperta u ma jistax jiġi immaġni. Il-kampjun jiġi skannjat punt b'punt bil-lejżer, u t-tubu fotomultiplikatur wara li jiskopri l-pinhole jikseb ukoll l-immaġni konfokali tal-punt tad-dawl korrispondenti punt b'punt, li jiġi kkonvertit f'sinjal diġitali u trasmess lill-kompjuter, u finalment aggregat fuq l-iskrin f'immaġni konfokali ċara tal-pjan fokali kollu. .
Kull immaġni tal-pjan fokali hija fil-fatt cross-section ottika tal-kampjun, u din is-sezzjoni trasversali ottika dejjem għandha ċerta ħxuna, magħrufa wkoll bħala porzjon ottiku. Peress li l-intensità tad-dawl fil-punt fokali hija ħafna akbar minn dik fil-punt mhux fokali, u d-dawl tal-pjan mhux fokali jiġi ffiltrat mill-pinhole, il-fond tal-kamp tas-sistema confocal huwa bejn wieħed u ieħor żero, u l-iskannjar tul il- L-assi Z jistgħu jirrealizzaw tomografija ottika, li jiffurmaw il-Osserva sezzjoni ottika bidimensjonali fil-post iffukat tal-kampjun. Li tgħaqqad l-iskannjar tal-pjan XY (pjan fokali) mal-iskannjar tal-assi Z (assi ottiku), billi jakkumula immaġini bidimensjonali ta 'saffi suċċessivi u proċessar b'softwer tal-kompjuter speċjali, tista' tinkiseb immaġni tridimensjonali tal-kampjun.
Jiġifieri, il-pinhole tas-sejbien u l-pinhole tas-sors tad-dawl huma dejjem iffukati fuq l-istess punt, sabiex il-fluworexxenza eċċitati barra l-pjan li jiffoka ma tistax tidħol fil-pinhole ta 'skoperta.
L-espressjoni sempliċi tal-prinċipju tax-xogħol tal-laser konfokali hija li juża lejżer bħala s-sors tad-dawl, u fuq il-bażi tal-immaġni tal-mikroskopju fluworexxenti tradizzjonali, apparat tal-iskannjar tal-lejżer u apparat li jiffoka konjugat huma mwaħħla, u l-akkwist u l-ipproċessar tal-immaġni diġitali sistema hija kkontrollata minn kompjuter.
